酶法制备GABA是一个不可逆反应,适宜的酸脱羧酶温度可以使GABA转化率达到最大,所以通过设置不同的枯草酶转化温度来探究温度对GABA转化率的影响。以100g/L的芽孢用谷氨酸为底物,溶于去离子水中,表达加入湿菌体(在55℃水浴锅预处理50min,谷氨杆菌改善细胞膜的酸脱羧酶通透性)30U/g,在150r/min的枯草水浴摇床中进行转化,反应过程中,芽孢用控制pH为5.0。表达温度梯度设置为25、谷氨杆菌30、酸脱羧酶35、枯草40、芽孢用45、表达50℃,反应24h后终止反应并进行煮沸处理,12000r/min离心5min得上清液,适当稀释并过0.22μm有机滤膜后用HPLC-OPA柱前衍生法进行检测,结果见图9。转化率随温度升高逐渐提高.当转化温度达到40℃时,GAD-0和GAD-PL转化率达到最高,分别为64.78%和82.27%,继续升高温度,转化率反而降低。这是因为枯草芽孢杆菌细胞壁厚,而反应温度过低时,底物与胞内酶液无法充分接触使得转化率低:当反应温度过高时,酶与PLP稳定性差,从而影响GABA的转化率。
以100g/L的谷氨酸为底物.溶于去离子水中,加入预处理过的湿菌体30U/g,在40℃、150r/min的水浴摇床巾进行转化,反应过程中,每隔2h用0.6mol/L的H2S04或NaOH调节pH,使其始终与初始pH保持一致。pH梯度设置为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0,反应24h后终止反应并进行煮沸处理,12000r/min离心5min得上清液,适当稀释并过0.22μm有机滤膜后用HPLC-OPA柱前衍生法进行检测。结果见图10,当pH为4.5或5.0时,GABA转化率最高,GAD-0的GABA转化率为75.45%和76.21%,GAD-PL的GABA转化率为84.54%和84.21%。当DH小于4.5时,底物-水谷氨酸钠在酸性条件下容易酸水解生成谷氨酸析出,从而形成乳白色浑浊液体.不利于酶与底物的充分结合;当pH大于5.0时不利于酶活性巾心的赖氨酸残基以shifft-碱与PLP、底物结合,从而抑制GABA的生成。可见,酶转化法制备GABA的pH耐受范围窄,过酸或过碱都不利于酶促反应进行,考虑在高质量浓度底物下,过低的pH更容易导致底物析出,所以酶转化最适pH为5.0。
以100g/L的谷氨酸为底物,溶于去离子水中,加入预处理过的不同湿菌体(20、30、40、50、60U/g),在40℃、150r/min的水浴摇床中反应24h,反应过程中,控制pH为5.0。反应结束后进行煮沸处理,12000r/min离心5min得上清液,适当稀释后用氨基酸柱前衍生法进行HPLC检测。结果见图11,重组菌全细胞转化率随着加菌量的增加而逐渐提高,其中GAD-PL和GAD-0分别在40U/g和50U/g时将底物完全转化,转化率达到100%。GAD-PL的加菌量少于GAD-0是因为前者细胞巾的PLP含量高于后者,PLP作为辅助因子有利于酶促反应的进行。
以100g/L的谷氨酸为底物,溶于去离子水中,加入预处理过的不同湿菌体,GAD-0和GAD-PL加入量分别为50U/g和40U/g,在40℃、150r/min的水浴摇床中反应24h,反应过程中,控制DH为5.0。反应结束后进行煮沸处理,12000r/min离心5min得上清液,适当稀释后用HPLC-OPA柱前衍生法进行检测,结果见图12。在0~20h,GAD-0和GAD-PL转化合成GABA的产量随时问延长迅速增加,在20h时转化率达到100%,之后随着反应进行,转化率不再发生变化。
以200g/L的谷氨酸为初始底物,溶于去离子水中,加入预处理过的不同湿菌体,GAD-0和GAD-PL力口菌量分另0为50U/g和40U/g,在40℃、150r/min的水浴摇床中反应6h后,每隔3h补加1.27g的谷氨酸同体至底物质量浓度分别为200、250、300、350、400g/L,反应过程中,控制pH为5.0,反应48h。反应结束后进行煮沸处理,12000r/min离心5min得上清液,适当稀释并过0.22μm有机滤膜后用HPLC-OPA柱前衍生法进行检测。结果见图13,当底物质量浓度达到400g/L谷氨酸时,GAD-0和GAD-PL转化生产GABA的转化率分别从100%(底物质量浓度350g/L谷氨酸)下降为97.72%和98.43%。综合考虑,为提高工业生产效率和节省下游分离纯化成本,选择350g/L作为酶法制备GABA的最适底物质量浓度。
作者成功构建并重组表达了含有Escherichiacoli来源的gadB基因的重组菌B.subtilis/pHY300PLK-gadB。实验表明在发酵过程中添加0.5mmol/L辅酶前体PL的GAD总酶活达到28.14U/mL,是对照总酶活的1.72倍。进一步优化重组菌全细胞酶法生产GABA的工艺条件,结果表明,当温度为40℃,pH为5.0,GAD-0和GAD-PL的最适加菌量分别为50U/g和40U/g时,GABA转化率达到100%。当谷氨酸质量浓度为400g/L时,GABA产量分别为275.60扎和273.61g/L。综上所述,作者考察了菌体发酵培养过程中添加辅酶前体PL对重组菌产GAD及制备GABA的影响,开发了一种不需要在发酵过程和酶转化体系巾添加昂贵辅酶PLP就能高效生产GABA的T艺技术,为GABA在食品和医药行业中的广泛应用打下了坚实基础。
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